加入日期：2022.01.05 瀏覽次數(shù)：2736次
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| 在科學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展的今天，凝膠電泳作為非常重要的科研實(shí)驗(yàn)方法早已被廣泛應(yīng)用于蛋白和核酸的分離。而電泳圖像的采集、保存和相關(guān)處理分析主要依靠凝膠成像系統(tǒng)。凝膠成像系統(tǒng)中Western blot是一項(xiàng)在復(fù)雜樣本中檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平的技術(shù)，至今已有超過40年的歷史，并成為了蛋白質(zhì)研究中常用的工具之一。在凝膠成像系統(tǒng)中中蛋白質(zhì)電泳凝膠如何拍攝? 蛋白質(zhì)凝膠電泳操作說明： 1、把上述處理的樣品按1:1(V/V)與2×SDS凝膠加樣緩沖液混合，100℃加熱3分鐘，使蛋白質(zhì)變性; 2、取出變性蛋白質(zhì)，立即放于冰上。樣品如粘稠可進(jìn)行超聲對DNA進(jìn)行剪切，以最大功率處理0.5～2分鐘應(yīng)能有效地將裂解液粘稠度降至可控水平(注意：此步驟一定要在冰上進(jìn)行); 3、如有沉淀以10 000g將樣本4℃離心10分鐘，將上清液移至另一管中，棄去沉淀物; 4、計(jì)算使用Western印跡法檢測靶蛋白所需要的樣本量，一般Western印跡法技術(shù)檢測中等大小蛋白的檢出下限約為1～5ng。在厚0.75mm的SDS聚丙烯酰胺凝膠上，每個(gè)泳道可加樣100μg而不致過多; 5、 用玻璃微量進(jìn)樣器按順序加樣，注意沿加樣孔底上樣，否則樣品容易漂走。加樣量不宜過多或過少，一般15～20ul為宜。沒上樣的加樣孔中加1?SDS凝膠加樣緩沖液; 6、用注射器排除兩玻璃板底部的氣泡，將電泳裝置接通電源(正極接下槽，負(fù)極接上槽)，凝膠上所加電壓為8v/cm,當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后，電壓可提高到15V/cm,繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部(約4小時(shí))，關(guān)閉電源; 7、從電泳裝置上卸下玻璃板，放入一瓷盤中，用一注射器吸取若干毫升電泳緩沖液，將針頭插入一玻璃板與凝膠之間，小心不要將凝膠刺破，沿玻璃板從左至右注入電泳緩沖液，將玻璃板與凝膠分開。靠近左邊切去一角以標(biāo)明凝膠的位置; 8、如不需做免疫檢測可直接用考馬斯亮藍(lán)染色。 | |
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